Cromatografia de Interação Hidrofóbica

Já ouviu falar em HIC?

A Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC) separa as proteínas, peptídeos e outras biomoléculas com base em seu grau relativo de hidrofobicidade.

< Hidrofobicidade = Alta repelência a água >

No entanto, ao contrário da cromatografia de fase reversa, HIC é uma técnica não desnaturante, que mantém a atividade biológica.
Portanto, espera-se que a forma nativa das proteínas seja mantida, o que é importante caso se queira estudar mais características biológicas das proteínas separadas.

O princípio da adsorção de proteínas ao meio HIC é complementar à cromatografia de troca iônica e exclusão de tamanho.
Neste processo, as proteínas que passam pela coluna e que possuem cadeias laterais de aminoácidos hidrofóbicos em suas superfícies são capazes de interagir e se ligar aos grupos hidrofóbicos da coluna.

Moléculas de amostra contendo regiões hidrofóbicas e hidrofílicas são aplicadas a uma coluna HIC em um tampão de alto teor de sal.

< Hidrofílicas = Possuem afinidade com a água >

Em uma separação HIC, os ligantes hidrofóbicos na fase estacionária interagem com as regiões hidrofóbicas na superfície da proteína e o mecanismo de retenção se dá devido ao equilíbrio de adsorção – dessorção na presença de sais.

O sal no tampão reduz a solvatação dos solutos da amostra. À medida que a solvatação diminui, as regiões hidrofóbicas que ficam expostas são adsorvidas pelo meio. Quanto mais hidrofóbica a molécula, menos sal é necessário para promover a ligação.

A seguir está uma lista de sais que aumentam as interações hidrofóbicas na ordem de sua capacidade de aumentar as interações:

Na2SO4 – K2SO4 – (NH4) 2SO4 – NaCl – NH4Cl – NaBr – NaSCN

Normalmente, um gradiente decrescente de sal é usado para eluir amostras da coluna a fim de aumentar a hidrofobicidade.

Na prática, as proteínas ligam-se à fase estacionária de HIC na presença de alta concentração de sal e são eluídas na ordem de aumento da hidrofobicidade, diminuindo a concentração de sal.

A eluição da amostra também pode ser auxiliada pela adição de modificadores orgânicos suaves ou solução tampão de eluição. Lembrando que, neste caso, a temperatura e pH ajudam na resolução dos resultados obtidos.

Aplicação: a HIC tem sido cada vez mais utilizada em separações de proteína e proteína conjugada!

 

Por Pedro Alexandre

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